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Che Cos’è La Risoluzione Dei Problemi Relativi Alla Modifica…
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Nelle ultime volte, alcuni dei nostri utenti hanno menzionato le conversioni fisse di dh10bac.
Il contenuto multimediale utilizzato, in cui le cellule di insetti sono comunemente coltivate, hanno un ph acido (6,0-6,5) o utilizzano gruppi donatori di elettroni che possono interferire con il legame nella proteina Ni-NTA marcata 6xHis. Gli amminoacidi come la glutammina, la glicina, oltre a quella forse l’istidina, sono presenti nei mezzi di coltura cellulare di insetti a concentrazioni significativamente elevate rispetto ai mezzi di civiltà delle cellule di mammifero e competono con un paio di proteine marcate 6xHis per i siti di legame rispetto ai modelli Ni. -NTA. Grace’s Medium Technologies) (Life, ad esempio, contiene circa dieci millimetri di glutammina, 10 mM che coinvolgono la glicina e 11 mM di istidina associata.
Dializzare il supporto su un tampone impostato in modo appropriato e un pH (8,0) simile al tampone di lisi corrente consigliato progettato per la purificazione nativa generalmente ripristinerà le condizioni operative più efficaci. Si noti che, a seconda del mezzo comunemente usato, potrebbe probabilmente formarsi un precipitato bianco (probabilmente composto da sali insolubili), ma di solito la proteina principale specifica 6xHis-marcata rimane in avvicinamento. Questo può essere fatto sia una quantificazione delle proteine finale utilizzando un sistema privo di proteine o monitorando la quantità dalle proteine della salute etichettate con 6xHis utilizzando il Western blotting. Dopo la centrifugazione, la proteina 6xHis identificata richiesta può essere purificata direttamente in relazione al supernatante chiarificato.
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Ho ben preparato quattro plasmidi pFB-HTB con quattro storia genica di interesse, tutti solo sequenziato. Ho trasformato questi plasmidi direttamente in utili cellule DH10Bac per te secondo il protocollo Bac-to-Bac, inclusa la miscelazione per più di 4 ore prima della produzione nelle tue piastre e dopo ventiquattro ore di incubazione.
I quindi strappato alcune grandi colonie bianche per quanto riguarda la PCR con diversi primer M13 legati a ciascun tipo. Tutto ciò che ho in questo momento sono risultati negativi, 300 b.p. nei tanti campioni. Tuttavia, quando mi sono assicurato di tutti i passaggi e ho eseguito questo metodo di ricerca una seconda volta, ho ottenuto gli stessi sfortunati risultati.
Recentemente non riesco a capire se ci fosse qualche interesse Alcuni geni sono depositati in bacmida, perché i tuoi piatti avevano grandi colonie bianche in primo luogo?
Devo modificare le condizioni della PCR per ottenere il loro effetto positivo? O un’influenza negativa con bande di 300 bp. significa che generalmente non sono stati trasposti i geni in cui bacmid e ho bisogno di residui la trasformazione? O dovrei sistemare la PCR dopo 2-3 cicli di colonie bianche luminose? O qualcosa di diverso –
Grazie!
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Ultima risposta
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Ho sempre provato con M13 e ho tutti i gruppi estremamente 300 bp; ho ripetuto la giovane PCR con primer gene-specifici e una volta che ha funzionato per il gene iniziale.
Ho provato altri tre geni insieme a ha avuto di nuovo le stesse complicazioni, con primer geneticamente diversi. La persona ha risolto questo problema?
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Ciao Yu, non c’è bisogno di farti prendere dal panico. Di solito le tue città bianche sono corrette. Ti consiglio:
1, esegui una PCR sulla tua coppia di geni 101.
2, controlla questa trasposizione senza aggiungere l’intero plasmide e anche un antibiotico per un plasmide che ti assicurerà che ci saranno sicuramente colonie che tutta la tua famiglia potrebbe non avere.
3. Puoi anche saltare questo passaggio chiave di verifica dei fatti. Alternativa al 90% Da parte nostra, otterrai ciò di cui tutta la tua azienda ha bisogno. M13+
La PCR spesso seleziona un braccialetto PCR non specifico di cui le famiglie non hanno bisogno e che potresti preoccupare. E fai attenzione con il nostro aiuto e i nostri consigli per usare M13 101 con il tuo primer genico principale.
Buona fortuna.
Grazie per il supporto. Farò la cosa più importante per quanto riguarda il passaggio successivo.
Smt. KW Sangli College 416416. Mahrashtra. INDIA
Piuttosto sicuro di quali t sono stati trasferiti su Bacmid, qualcuno potrebbe dover aggiornare il miglioramento.
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Ho una domanda completa: come assemblate esattamente le vostre piastre di allevamento? Non aggiungo mai IPTG e X-Gal all’agar, preparo l’agar intero con 3 mesi di antibiotici, decanto solo le piastre. Quando posso usare le piastre, striscio molte volte X-Gal e IPTG sull’agar, lascio asciugare le piastre per un’ora e quindi metto i miei batteri sopra. Funziona un minimo meglio.
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TheraIndx Lifesciences Pvt. Ltd.
Niente panico , ciò che è più spesso questo è ciò che accade. Se riesci a ottenere colonie senza mai il singolo gene in cui sei attivo, vengono chiamate pseudocolonie. Concordo con la discussione precedente. Prova a ripetere la conversione. Saluti
Ho seguito il consiglio di Ziguo Zhang e ho imbiancato il insediamenti lungo le piastre due volte (otto colonie plasmide singolo) e DNA bacmide isolato (totale 4*8 = 32 campioni) dopo aver investito in otto colonie bianche e anche una particolare colonia blu ogni terza quantità di cibo e versando nei composti LB di kanamicina, gentamicina e tetraciclina per 24 ore. orologio. Gli organismi mostrati in blu non sono tornati nel LB contenente tre antibiotici positivi.
E ad un certo punto ho usato i primer m13 per la PCR come metodo per identificare inizialmente la bacmida. L’ambiente della PCR era identico al metodo bac-to-bac. Tuttavia, i risultati hanno nuovamente lasciato perplessi tutti. Le dimensioni per ogni bacmid PCR dovrebbero essere ~5500, ~4300 thin, ~3900, ~4500. E alcuni dei molto più mostrati nell’elettroforesi su gel all’1% sono sicuramente compresi tra 2000-3000, tra 2000-3000 come 3000, tra 2000 e 3000.
Ora ottimizzo i parametri approssimativi di alcune delle reazioni PCR e ciclo e disegnare sul primer M13 a coppie, considerando il primer di ciascun gene, in modo da poter eseguire la PCR.
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